Microscopio Gigapixel desktop: 10 passaggi (con immagini)

2024 Autore: John Day | [email protected]. Ultima modifica: 2024-01-30 10:02

Nei microscopi ottici, esiste un compromesso fondamentale tra campo visivo e risoluzione: più il dettaglio è fine, più piccola è la regione ripresa dal microscopio. Un modo per superare questa limitazione è tradurre il campione e acquisire immagini su un campo visivo più ampio. L'idea di base è unire molte immagini ad alta risoluzione per formare un grande FOV. In queste immagini, puoi vedere sia il campione completo, sia i dettagli più fini in qualsiasi parte del campione. Il risultato è un'immagine composta da circa un miliardo di pixel, molto più grande rispetto alle immagini scattate da una reflex digitale o uno smartphone, che in genere hanno da 10 a 50 milioni di pixel. Dai un'occhiata a questi paesaggi gigapixel per un'impressionante dimostrazione dell'enorme quantità di informazioni in queste immagini.

In questo tutorial, esaminerò come costruire un microscopio in grado di visualizzare un campo visivo di 90 mm x 60 mm con pixel corrispondenti a 2 μm sul campione (anche se penso che la risoluzione sia probabilmente più vicina a 15 μm). Il sistema utilizza obiettivi per fotocamere, ma lo stesso concetto può essere applicato utilizzando obiettivi per microscopio per ottenere una risoluzione ancora più fine.

Ho caricato su EasyZoom le immagini gigapixel che ho acquisito con il microscopio:

Immagine della rivista National Geographic del 1970

Tovaglia all'uncinetto fatta da mia moglie

Elettronica varia

Altre risorse:

Tutorial di microscopia ottica:

Risoluzione ottica:

Oltre all'unione delle immagini, i recenti progressi nell'imaging computazionale rendono possibile la microscopia gigapixel senza nemmeno spostare il campione!

Passaggio 1: elenco dei rifornimenti

Materiali:

1. Nikon DSLR (ho usato la mia Nikon D5000)

2. Obiettivo con lunghezza focale da 28 mm con filettatura da 52 mm

3. Obiettivo con lunghezza focale da 80 mm con filettatura da 58 mm

4. Accoppiatore inverso da 52 mm a 58 mm

5. Treppiede

6. Sette fogli di compensato di 3 mm di spessore

7. Arduino Nano

8. Due H-bridge L9110

9. Due emettitori IR

10. Due ricevitori IR

11. Pulsante

12. Due resistori da 2.2kOhm

13. Due resistori da 150Ohm

14. Un resistore da 1kOhm

15. Scatto remoto per fotocamera Nikon

16. Cartellonistica nera

17. Kit hardware:

18. Due motori passo-passo (ho usato il motore passo-passo Nema 17 bipolare 3.5V 1A)

19. Due madreviti da 2 mm

20. Quattro blocchi cuscino

21. Due madreviti per viti

22. Due boccole di scorrimento dei cuscinetti e alberi lineari da 200 mm:

23. Alimentazione 5V:

24. Filo di avvolgimento del filo

Utensili:

1. Taglio laser

2. Stampante 3D

3. Chiavi a brugola

4. Tagliafili

5. Strumento per avvolgere il filo

Passaggio 2: panoramica del sistema

Per traslare il campione, due motori passo-passo allineati in direzioni ortogonali spostano uno stadio nella direzione x e y. I motori sono controllati utilizzando due H-bridge e un Arduino. Un sensore IR posizionato alla base del motore passo-passo viene utilizzato per azzerare gli stadi in modo che non vadano a sbattere contro nessuna delle estremità dei blocchi. Un microscopio digitale è posizionato sopra il tavolino XY.

Una volta posizionato il campione e centrato il tavolino, si preme un pulsante per iniziare l'acquisizione. I motori spostano il palco nell'angolo in basso a sinistra e la telecamera viene attivata. I motori quindi traducono il campione in piccoli passaggi, mentre la fotocamera scatta una foto in ogni posizione.

Dopo che tutte le immagini sono state scattate, le immagini vengono quindi unite per formare un'immagine gigapixel.

Passaggio 3: assemblaggio del microscopio

Ho realizzato un microscopio a basso ingrandimento con una reflex digitale (Nikon 5000), un obiettivo Nikon 28mm f/2.8 e un obiettivo zoom Nikon 28-80mm. L'obiettivo zoom è stato impostato per una lunghezza focale pari a 80 mm. L'insieme delle due lenti agisce come una lente del tubo del microscopio e una lente dell'obiettivo. L'ingrandimento totale è il rapporto tra le lunghezze focali, circa 3X. Queste lenti in realtà non sono progettate per questa configurazione, quindi per far propagare la luce come un microscopio, devi posizionare un diaframma di apertura tra le due lenti.

Innanzitutto, monta l'obiettivo a lunghezza focale più lunga sulla fotocamera. Ritaglia un cerchio da un cartoncino nero che abbia un diametro all'incirca delle dimensioni della superficie anteriore dell'obiettivo. Quindi tagliare un piccolo cerchio al centro (ho scelto circa 3 mm di diametro). La dimensione del cerchio determinerà la quantità di luce che entra nel sistema, chiamata anche apertura numerica (NA). La NA determina la risoluzione laterale del sistema per microscopi ben progettati. Allora perché non usare un NA alto per questa configurazione? Bene, ci sono due ragioni principali. In primo luogo, all'aumentare della NA, le aberrazioni ottiche del sistema diventano più evidenti e limiteranno la risoluzione del sistema. In una configurazione non convenzionale come questa, probabilmente sarà così, quindi aumentare la NA alla fine non aiuterà più a migliorare la risoluzione. In secondo luogo, anche la profondità di campo dipende da NA. Maggiore è la NA, minore è la profondità di campo. Ciò rende difficile mettere a fuoco oggetti che non sono piatti. Se la NA diventa troppo alta, sarai limitato ai vetrini per microscopio, che hanno campioni sottili.

Il posizionamento del diaframma di apertura tra i due obiettivi rende il sistema approssimativamente telecentrico. Ciò significa che l'ingrandimento del sistema è indipendente dalla distanza dell'oggetto. Questo diventa importante per unire le immagini insieme. Se l'oggetto ha una profondità variabile, la vista da due diverse posizioni avrà una prospettiva spostata (come la visione umana). Unire insieme immagini che non provengono da un sistema di imaging telecentrico è impegnativo, soprattutto con un ingrandimento così elevato.

Utilizzare l'accoppiatore inverso dell'obiettivo da 58 mm a 52 mm per collegare l'obiettivo da 28 mm all'obiettivo da 80 mm con l'apertura posizionata al centro.

Passaggio 4: progettazione del palcoscenico XY

Ho progettato il palco utilizzando Fusion 360. Per ogni direzione di scansione, ci sono quattro parti che devono essere stampate in 3D: supporto per montaggio, due estensori per unità di scorrimento e un supporto per vite. La base e le piattaforme del palco XY sono tagliate al laser da compensato di 3 mm di spessore. La base contiene il motore della direzione X e i cursori, la piattaforma X contiene il motore e i cursori della direzione Y e la piattaforma Y contiene il campione. La base è composta da 3 fogli e le due piattaforme sono costituite da 2 fogli. In questo passaggio vengono forniti i file per il taglio laser e la stampa 3D. Dopo aver tagliato e stampato queste parti, sei pronto per i passaggi successivi.

Passaggio 5: montaggio del supporto motore

Usando uno strumento avvolgicavo, avvolgi il filo attorno ai cavi di due emettitori IR e due ricevitori IR. Codifica a colori i fili in modo da sapere quale estremità è quale. Quindi tagliare i cavi dai diodi, quindi solo i fili dell'avvolgimento del filo corrono da allora. Far scorrere i cavi attraverso le guide nel supporto del motore e quindi spingere i diodi in posizione. I fili sono diretti in modo che non siano visibili fino a quando non escono dal retro dell'unità. Questi fili possono essere uniti con i fili del motore. Ora monta il motore passo-passo usando quattro bulloni M3. Ripetere questo passaggio per il secondo motore.

Passaggio 6: montaggio della fase

Incolla insieme i tagli Base 1 e Base 2, uno dei quali con aperture esagonali per i dadi M3. Una volta che la colla si è asciugata, martella i dadi M3 in posizione. I dadi non ruoteranno quando vengono premuti nella scheda, quindi potrai avvitare i bulloni in un secondo momento. Ora incolla il terzo foglio di base (Base 3) per coprire i dadi.

Ora è il momento di assemblare il supporto del dado di piombo. Eliminare qualsiasi filamento extra dal supporto e quindi spingere quattro dadi M3 in posizione. Si adattano perfettamente, quindi assicurati di liberare lo spazio del bullone e del dado con un piccolo cacciavite. Una volta che i dadi sono allineati, spingere il dado nel supporto e fissarlo con 4 bulloni M3.

Fissare i blocchi cuscino, i supporti del cursore e il supporto del motore per il traslatore lineare in direzione X sulla base. Mettere il gruppo della chiocciola sulla madrevite e quindi far scorrere la madrevite in posizione. Utilizzare l'accoppiatore per collegare il motore alla vite di comando. Posizionare le unità del cursore nelle aste e quindi spingere le aste nei supporti del cursore. Infine, fissa gli estensori del supporto del cursore con i bulloni M3.

I fogli di compensato X1 e X2 sono incollati insieme in modo simile alla base. La stessa procedura viene ripetuta per il traslatore lineare in direzione Y e per lo stadio campione.

Passaggio 7: Elettronica dello scanner

Ogni motore passo-passo ha quattro cavi collegati a un modulo H-bridge. I quattro cavi dell'emettitore e del ricevitore IR sono collegati ai resistori secondo lo schema sopra. Le uscite dei ricevitori sono collegate agli ingressi analogici A0 e A1. I due moduli H-bridge sono collegati al pin 4-11 dell'Arduino Nano. Un pulsante è collegato al pin 2 con un resistore da 1kOhm per un semplice input dell'utente.

Infine, il pulsante di attivazione per la reflex digitale è collegato a un otturatore remoto, come ho fatto per il mio scanner CT (vedi passaggio 7). Tagliare il cavo dell'otturatore remoto. I fili sono etichettati come segue:

Giallo – fuoco

Rosso – otturatore

Bianco – terra

Per mettere a fuoco lo scatto, il filo giallo deve essere collegato a terra. Per scattare una foto, sia il filo giallo che quello rosso devono essere collegati a terra. Ho collegato un diodo e il cavo rosso al pin 12, quindi ho collegato un altro diodo e il cavo giallo al pin 13. L'installazione è come descritto in Istruzioni e trucchi fai-da-te.

Passaggio 8: acquisizione di immagini Gigapixel

In allegato il codice per il microscopio gigapixel. Ho usato la libreria Stepper per controllare i motori con l'H-bridge. All'inizio del codice, è necessario specificare il campo visivo del microscopio e il numero di immagini che si desidera acquisire in ciascuna direzione.

Ad esempio, il microscopio che ho realizzato aveva un campo visivo di circa 8,2 mm x 5,5 mm. Pertanto, ho diretto i motori a spostarsi di 8 mm nella direzione x e di 5 mm nella direzione y. Vengono acquisite 11 immagini in ciascuna direzione, per un totale di 121 immagini per l'intera immagine gigapixel (maggiori dettagli al riguardo nel passaggio 11). Il codice calcola quindi il numero di passi che i motori devono compiere per traslare lo stadio di questa quantità.

Come fanno gli stadi a sapere dove si trovano rispetto al motore? Come si traducono le fasi senza colpire nessuna delle due estremità? Nel codice di installazione, ho scritto una funzione che sposta lo stadio in ogni direzione fino a quando non interrompe il percorso tra l'emettitore IR e il ricevitore IR. Quando il segnale sul ricevitore IR scende al di sotto di una certa soglia, il motore si ferma. Il codice quindi tiene traccia della posizione dello stage rispetto a questa posizione iniziale. Il codice è scritto in modo che il motore non trasli troppo lontano, il che farebbe funzionare lo stadio nell'altra estremità della madrevite.

Una volta che il palco è calibrato in ogni direzione, il palco viene traslato al centro. Usando un treppiede, ho posizionato il mio microscopio DSLR sul tavolino. È importante allineare il campo della telecamera con le linee incrociate sul tavolino del campione. Una volta che il palco è allineato con la telecamera, ho fissato il palco con del nastro da pittore e poi ho posizionato il campione sul palco. La messa a fuoco è stata regolata con la direzione z del treppiede. L'utente preme quindi il pulsante per iniziare l'acquisizione. Lo stage si traduce nell'angolo in basso a sinistra e la fotocamera viene attivata. Lo stage quindi esegue la scansione raster del campione, mentre la fotocamera scatta una foto in ogni posizione.

Inoltre è allegato un codice per la risoluzione dei problemi dei motori e dei sensori IR.

Passaggio 9: unione delle immagini

Con tutte le immagini acquisite, ora devi affrontare la sfida di unirle tutte insieme. Un modo per gestire l'unione delle immagini è allineare manualmente tutte le immagini in un programma di grafica (ho usato Autodesk's Graphic). Funzionerà sicuramente, ma può essere un processo doloroso e i bordi delle immagini sono evidenti nelle immagini gigapixel.

Un'altra opzione consiste nell'utilizzare tecniche di elaborazione delle immagini per unire automaticamente le immagini. L'idea è di trovare caratteristiche simili nella sezione sovrapposta di immagini adiacenti e quindi applicare una trasformazione di traduzione all'immagine in modo che le immagini siano allineate l'una con l'altra. Infine, i bordi possono essere fusi insieme moltiplicando la sezione sovrapposta per un fattore di peso lineare e sommandoli tra loro. Questo può essere un algoritmo scoraggiante da scrivere se sei nuovo nell'elaborazione delle immagini. Ho lavorato per un po' sul problema, ma non sono riuscito a ottenere un risultato completamente affidabile. L'algoritmo ha avuto maggiori difficoltà con campioni che avevano caratteristiche molto simili in tutto, come i punti nell'immagine della rivista. In allegato è il codice che ho scritto in Matlab, ma ha bisogno di un po' di lavoro.

L'ultima opzione è quella di utilizzare i programmi di cucitura fotografica gigapixel. Non ho nessuno da suggerire, ma so che sono là fuori.

Passaggio 10: prestazioni del microscopio

Nel caso ve lo foste perso, ecco i risultati: immagine di una rivista, tovaglia all'uncinetto ed elettronica varia.

Le specifiche del sistema sono elencate nella tabella sopra. Ho provato a fotografare sia con un obiettivo di lunghezza focale da 28 mm che da 50 mm. Ho stimato la migliore risoluzione possibile del sistema in base al limite di diffrazione (circa 6μm). In realtà è difficile testarlo sperimentalmente senza un obiettivo ad alta risoluzione. Ho provato a stampare un file vettoriale elencato su questo forum di fotografia di grande formato, ma ero limitato dalla risoluzione della mia stampante. Il meglio che ho potuto determinare con questa stampa è stato che il sistema aveva una risoluzione <40μm. Ho anche cercato caratteristiche piccole e isolate sui campioni. La caratteristica più piccola nella stampa della rivista è la macchia d'inchiostro, che ho stimato essere anch'essa di circa 40 μm, quindi non ho potuto usarla per ottenere una stima migliore per la risoluzione. C'erano piccoli puntini nell'elettronica che erano abbastanza ben isolati. Poiché conoscevo il campo visivo, potevo contare il numero di pixel che occupano il piccolo divot per ottenere una stima della risoluzione, circa 10-15μm.

Nel complesso, sono rimasto soddisfatto delle prestazioni del sistema, ma ho alcune note nel caso volessi provare questo progetto.

Stabilità del tavolino: in primo luogo, procuratevi componenti per tavolini lineari di alta qualità. I componenti che ho usato avevano molto più gioco di quanto pensassi. Ho usato solo uno dei supporti del cursore nel kit per ogni canna, quindi forse era per questo che il palco non sembrava molto stabile. Il palco ha funzionato abbastanza bene per me, ma questo sarebbe diventato più un problema per i sistemi di ingrandimento più elevati.

Ottica per una risoluzione maggiore: la stessa idea può essere utilizzata per microscopi con ingrandimento maggiore. Tuttavia, saranno necessari motori più piccoli con passo più fine. Ad esempio, un ingrandimento di 20X con questa reflex digitale comporterebbe un campo visivo di 1 mm (se il microscopio può visualizzare un sistema così grande senza vignettatura). Electronupdate ha utilizzato motori passo-passo da un lettore CD in una bella struttura per un microscopio a più alto ingrandimento. Un altro compromesso sarà la profondità di campo ridotta, il che significa che l'imaging sarà limitato a campioni sottili e sarà necessario un meccanismo di traduzione più fine nella direzione z.

Stabilità del treppiede: questo sistema funzionerebbe meglio con un supporto per fotocamera più stabile. Il sistema di obiettivi è pesante e il treppiede è inclinato di 90 gradi rispetto alla posizione per cui è progettato. Ho dovuto fissare i piedi del treppiede per aiutare con la stabilità. L'otturatore potrebbe anche scuotere la fotocamera abbastanza da sfocare le immagini.